细胞和基因疗法

临床前

Preclinical in vitro and in vivo proof-of-concept, pharmacology, and toxicology studies are conducted to establish feasibility and rationale for clinical use of the investigational cellular and gene therapy cellular and gene therapy (CGT) product, as well as to characterize the product’s safety profile. These studies also serve as the scientific basis to support the conclusion that it is reasonably safe to conduct the proposed clinical investigations. Due to the diversity of CGT products, it is important to conduct a careful benefit-risk analysis, performed in the context of the particular clinical condition under study. Preclinical data derived from studies conducted in appropriate animal species and animal models of disease contribute to defining reasonable risk for the investigational CGT product.

临床前研究旨在定义预测人类反应的药理和毒理学作用，不仅在开始临床试验之前，而且在整个药物开发之前。这些研究的目标包括以下内容：定义安全的起始剂量和升级方案的临床试验，以确定目标器官的毒性和参数，以监测接受这些疗法的患者的监测，并确定可能面临更大风险的人群给定的细胞或基因治疗。

临床前研究的设计应考虑：1）要施用的细胞群体或使用的矢量类别，2）动物物种和生理状态与临床指示和产品类别最相关，以及3）预期剂量，预期的剂量，给药途径和治疗方案。

阶段1

这准备和收获细胞和基因疗法的期包括测试动物进行提取的适应。动物工作站在动物处理过程中，必不可少的目的主要用于人员和环境保护。

随着Viva®范围的引入，ESCO将清洁空气技术的数十年经验应用于动物研究实验室，保护人员和实验室环境：

• 与用于执行常规畜牧业的设备，材料和实践有关的危害；
• 直接或间接与动物接触有关的危害；
• 与动物研究过程中可能使用的技术或材料或生化物质有关的危害。

此阶段还涵盖了细胞收集过程，因此，考虑到该物种的细胞/组织之前和/或之后，考虑以下标准非常重要：

• 细胞类型：要使用的细胞类型应分类为自体，同种异体或异种。应该提供组织源和其他相关识别信息。
• 捐助者选择标准：应指定捐赠者的任何相关特征，包括年龄和性别。排除标准应着重于HIV-1和HIV-2，乙型肝炎和C病毒，HTLV-1和其他传染性剂的感染的存在或可能性。应指定从供体获得的血清学，诊断和临床历史数据。
• 组织打字：如果要使用同种异体供体，则应在适当的情况下包括多态性（例如血型）。应当解决捐赠者和接受者之间的组织相容性抗原（HLA I类和/或II，也许是次要抗原）的重要性，并应解决提供的程序和验收标准。

阶段2

遗传物质的转移可以通过局部或全身接种或离体在体内完成，在返回宿主之前，在生物体外收集和修饰了感兴趣的目标。合成DNA的转移可以通过转导或转染来实现。这种转移方法包括将DNA直接注射到受体细胞中，或利用诱导膜通透性，受体介导的摄取或内吞作用的方法。转导利用重组病毒作为基因转移的载体。

虽然遗传物质的天然转移可以通过多种方式完成，但由于生物学酶，质粒DNA的降解很容易受到影响，因此使用了以下合成递送系统：

• 离子噬菌体

离子噬菌体是一种非侵入性的方法，它是通过在排斥的电荷上通过排斥的电荷来推动高浓度的带电药物或生物活性剂的方法，该方法使用施加在含有类似带电的活性剂及其车辆的离子噬菌体室的小电荷。


• 电穿孔或电纸涂

这是由极度施加的电场引起的细胞质膜的电导率和渗透率的显着提高。它通常用作将某些物质引入细胞的一种方式，例如用分子探针加载，可以改变细胞功能的药物或一块编码DNA。


• 脂质体

这是一个球形囊泡，其膜由磷脂和胆固醇双层组成。脂质体可以由具有混合脂质链或纯表面活性剂的自然衍生的磷脂组成。为了将分子传递到作用位点，脂质双层可以与其他双层（例如细胞膜）融合，以传递脂质体含量。


• 注射器

喷油器是一种类似泵的设备，在压力下为容器充电或放电以适当的排列。从处于压力下的合适气体或液体从入口处获得动力。气动注射器可以输送10-15 L材料的材料，专门的机械泵能够提供10-12 L Picolitre递送量。

阶段3

用于组织工程和再生的脚手架可以是合成聚合物，天然衍生的蛋白/聚合物以及脱细胞产生的组织衍生的支架。合成支架可以通过受控的机械性能，孔隙率和表面形貌轻松地量身定制和再现。但是，这种方法面临诸如有关降解率和产品的不确定性以及细胞兼容性的局限性。天然衍生的蛋白/聚合物（例如胶原蛋白，纤维蛋白，藻酸盐）具有内在的细胞兼容性，但它们的机械性能通常很弱且难以操纵。

另一方面，脱皮化可以去除组织/器官中的细胞成分，以产生细胞外基质模板，这是可用于组织工程应用的结构和功能蛋白的复杂混合物。从组织来源的支架中去除细胞含量和抗原可减少异物反应，炎症和潜在的免疫排斥。有效的脱细胞方法包括化学，酶，物理或组合方法。这些方法的工作原理是通过破坏细胞膜，然后会导致细胞含量释放并冲洗掉。

脱细胞包括化学方法，例如使用硫酸钠（SDS），非离子洗涤剂（Triton X-100），螯合剂（EDTA），基于ZWITTRITICINIC的洗涤剂，酸和碱，低血压和高血压溶液，低血压解决方案，低血压解决方案，低血压剂，螯合剂（EDTA）等离子洗涤剂的利用。醇和丙酮和酶促方法，例如胰蛋白酶处理。物理方法，例如刮擦，溶液搅拌，压力梯度和冷冻。

后来对脚手架进行消毒，以防止病原体的污染和潜在传播。灭菌涉及使用不育测试隔离器和细胞支架，包括乙醇，乙酸，氧化乙烷，紫外线和伽马辐射。除了灭菌外，还使用脚手架稳定来延迟降解，中和抗原和稳定ECM的整体结构。

通用平台处理隔离器（GPPI）特别设计为不育测试隔离器。

冷冻保存或溶液化还在脱细化方法中都使用了脚手架的存储，以便于处理。冷冻保存能够有效保留液氮维持的零下温度下的细胞组织支架。

现在，使用Sublimate®完美地完成了不同的冷冻干燥应用，例如保存生物样品，蛋白质的纯化以及化学产品的浓度。

还应在再生疗法的第三阶段中考虑以下标准：

• 质量控制程序：通常，应根据材料质量，制造控制以及设备验证和监测来仔细管理细胞培养操作。
• 文化传媒：应为所有媒体和组件建立接受标准，包括验证血清添加剂和增长因素，以及验证免于不定代理的自由。应避免具有引起敏化的潜力，例如某些动物血清，选定的蛋白质和血型物质。对于生长因素，应建立身份，纯度和效力的度量，以确保细胞培养特征的可重复性。


CELCRADLE™是一种可用于蛋白质表达，病毒和单克隆抗体产生的可用于高密度细胞培养的一次性生物反应器。它的设计基于孔隙诱导的介质间歇流和空气通过细胞居住的多孔矩阵的概念。这提供了低剪切，高充气和无泡沫的培养环境。

• 细胞培养中的不定代理：应提供文档作为证明，证明细胞正在处理，繁殖并在旨在最大程度地减少对不定药污染的条件下进行实验室程序。在长期培养过程中，应定期测试细胞以进行污染。测试应确保细胞不含细菌，酵母，霉菌，支原体和不定病毒。
• 监测细胞身份和异质性：都应实施制造和测试程序，以确保对身份和异质性的细胞培养进行控制。

应设计细胞培养实践和设施，以避免与另一种细胞培养物污染一种细胞培养。

在细胞培养过程中，可能会发生在细胞群体的特性中广泛漂移或最初数量低的其他细胞类型过度生长。为了检测这种变化，应通过监测细胞表面抗原或生化标记来定量评估细胞身份。选择的识别方法还应能够检测到设施中使用的其他单元格的污染或替代。应定义可接受的文化组成限制。功能效力的定量测定有时可能为种群表型提供一种方法。当细胞进行操作时，应监测所需的函数，并定期进行测试以确保保留所需的性状。在某些情况下，身份测试应包括验证供体 - 复发匹配和免疫学表型的验证。

• 治疗实体的特征：如果预期的治疗作用基于细胞合成的特定分子物种，则应提供足够的结构和生物学信息，以表明存在适当且具有生物活性的形式。
• 文化长寿：应定义培养的细胞群（表面抗原，功能特性，生物测定的活性）的基本特征，并应定义这些特征，并且这些特征在培养时间中建立的这些特征的稳定性。该轮廓应用于定义培养期的限制。

第4阶段

微生系统技术的主要进展是创建与生物传感元素结合使用的小型，综合和可靠的微转化器设备，在过去十年中彻底改变了生物传感器领域。这种微生物传感器系统提高了人们对动态细胞代谢事件的全面见解，并随后对人类生物学的代谢有完整的理解。

再生药品的质量控制

• 风险和不育

两个不同的关键因素控制着涉及细胞/基因治疗的无菌药物的无菌处理。首先是“风险评估/分析”，其目标是风险量化。另一个是“降低风险”，它考虑了设施设计，设备选择，过程定义以及过程本身的操作期间污染的可能性。降低风险既可以指示进程的需求水平，又可以确定应分配给缓解活动的优先级。与之相关的风险缓解无菌处理通常意味着正确控制人类干预措施，但最终如果要最大化风险，则必须将人员完全从无菌处理的关键领域中完全删除，或者应利用不育测试隔离器。

• 礼服的有效性

一些科学家和工程师一直认为，如果适当地进行无菌磨损的无菌礼服并在进行工作时表现出声音无菌技术，则可以充分维持无菌状况。但是，从公开的研究数据中可以明显看出，人员会向环境发出非常高水平的微生物污染。即使选择了最先进的礼服并正确穿着，也是如此。根据Ljungqvist等人的说法，即使在涉及有限操作的过程中，穿着先前未使用的消毒礼服的人员也会发出1500–3000 CFU/h的微生物污染。

在需要执行许多物理任务的复杂操作过程中，人员释放的微生物污染可能会增加到≥10,000cfu/h。

人皮肤上存在的有氧细菌总数通常为每平方米120万。在健康人的手和手臂上存在的微生物数量在每平方米0.9-3百万。礼服人员在操作过程中通过技术人员的泵送效果发出微生物。因此，先进的无菌处理技术，例如打填充密封和限制访问障碍系统在隔离器之上（复合的无菌遏制隔离器和复合的无菌隔离器）用于减少人员引起的产品污染的可能性。



封闭的Rabs是隔离器和开放式RAB之间的中间溶液。封闭的操作RABS提供了更高水平的污染控制，因为Rabs的屏障门从上次生物污染的点，通过初始设置和处理。这些系统通常使用类似于闭合并与RAB停靠的隔离器类型传输系统相似的传输系统。

• 基因/细胞疗法的隔离器技术

隔离器系统不允许人员直接干预围栏的无菌处理区域。为了确保不会将污染引入隔离器中，至关重要的是要以不损害并允许封闭内部污染物泄漏的方式将材料带入和退出隔离器。隔离器提供的不育保证是人员的物理分离的产物，消除了引入空气污染的风险以及阻止将非紧密材料引入隔离器的系统。可以通过使用称为净化通道盒和圆形快速传输端口（RTP）的设备来确保将材料无污染传输到隔离器中；还为隔离器开发了去污界面。

需要大量空气以适当满足洁净室空气的国际标准。空气处理系统例如隔离器以及构建和设计整理房间至关重要，因为这些将在无菌复合过程中命令允许的过程。

ISO 5/级A级环境是无菌处理的关键领域所需的。无菌处理中的关键区域定义为设施的一部分，在该设施中，将产品和灭菌组件聚集在一起，填充和/或组装。有必要在ISO 7/级B环境中安装和操作此ISO 5/级A关键区域环境。对此同样重要的是提供适当的礼服和支持设施，以确保安全，无污染物的人员和组件进入。另外，在某些现代设施中，整个无菌处理室都可以设计为ISO 5/级A级要求；但是，这样的设施既构建和运营都很昂贵。

设施和公用事业要求是过程流量和生产效率的基本支持。在设施设计中，重要的是要考虑行业的监管性质，并寻求对需求的深入了解，因此为安全，有效和纯净的药物提供最基本的基础，同时保持其成本效益。

洁净室对于生物制剂的制造至关重要，因此使用十字架污染设施集成屏障（CCFIB）可以用来最大程度地提高洁净室的性能，以确保任何药品的完整性和质量。该设备将最大程度地减少化学或生物污染物的暴露，例如微生物或不定药，从而为产品，操作员和环境提供最大的保护。



这Cradlepro-ISO是一个集成系统，结合了ESCO Versati™离心机，ESCO CO2孵化器和ESCO HPI G3内部的Celcradle™台式生物反应系统。CELCRADLE™系统为细胞提供低剪切应力，零泡沫和高曝气速率和营养速率的环境，而CO2孵化器控制周围条件周围的细胞。

CradlePro-ISO旨在将电池处理系统完全封闭在隔离器中，以确保操作员的安全性，而不会损害产品的质量。

兔子隔离器可用于生物制造，包括疫苗，基因疗法和基于蛋白质的药物。通常，生物制品不含防腐剂，含有生长培养基，并且容易受到污染。需要使用的另一个领域兔子隔离器是使用有毒，细胞毒性和高效分子的无菌药物制造，它们需要严格的障碍才能保护处理这些材料的人员。一般来说，兔子和隔离器用于较小体积和高价值药物。讨论障碍的使用时，必须考虑利益/成本余额：兔子隔离器的价格高标签，并与与清洁室的运营相关的其他费用，例如能源成本，运营成本，测试成本和礼服成本。

这些产品的商业生产和交付还包括其他CGMP要求。这些要求是但不限于：清洁，验证和调试，过程材料人员和空气流，冷藏，干燥存储，紧急程序，安全，安全，害虫防治，环境监测和预防性维护。

参考：

1. 腹部钥匙。（n.d。）。使用隔离器技术对再生医学产品的无菌制造。从...获得：https://abdominalkey.com/aseptic-manufacturing-of-regenerative-medicine-products-using-isolator-Technology/

2. 食品和药物管理局。（2015）。考虑到细胞和基因治疗产品的早期临床试验的设计：工业指南。从...获得：https://www.fda.gov/media/106369/download

3. 哈佛设备。（n.d。）。细胞修改和重新设计解决方案指南。从...获得：https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/cell%20modification%20and%20 angineering%20Guide.pdf