上游处理

细胞隔离是细胞培养研究中最基本的实践之一，并且有多种技术可以做到这一点。这两个过程的重要性在于目的是了解某些细胞机制，以制定新的生物药物并打击特定的疾病类型。为此，需要进行详细的生化分析。大多数程序都需要大量必须在物理上破坏的细胞，以便可以在纯文化中进一步隔离和增殖其成分以进行进一步分析。

如果目标细胞是组织的一部分，则必须首先将其解离并分离各种类型。破坏将细胞组合在一起的细胞外基质是分离组织样品的特定细胞的第一步。正如研究所表明的那样，可行解离的细胞的最佳来源是胎儿或新生儿组织的细胞。

破坏基质的过程涉及用蛋白水解酶和螯合剂处理组织样品：前者将消化细胞外基质中的蛋白质，而后者将结合或螯合钙（CA）²⁺）在基质中打破细胞细胞粘附。之后，进行轻柔的搅动以获得可用的单个活细胞。但是，从此过程中获得的样品由几种类型的单元组成，因此下一部分涉及将不同的单元格类型与悬浮液分离出来。

从悬浮液中隔离不同类型的细胞涉及利用它们的生理变化。通过离心和其他细胞强烈粘附于玻璃或塑料的能力更好地利用了这一点，并且是一种精致的技术，即只能与一种细胞类型结合的特定抗体。

但是，一种更复杂的细胞分离方法是通过使用与荧光染料组合的抗体。该组合用于标记特定的细胞，因此可以通过电子荧光激活的细胞分落者轻松地通过未标记的细胞分离它们。这台机器可以轻松地从1000个未标记的1000个池中清除1个荧光单元，并且可以对每秒千分之一的单元进行排序！它通过允许单个细胞通过激光束在每个电池的荧光中迅速测量的激光束传播。

细胞分离的另一种形式是激光捕获显微解剖（LCM），它允许从异源混合物或活细胞甚至细胞学制剂中分离出纯细胞。该过程提取的DNA，RNA和蛋白质生物分子可用于下游应用，例如聚合酶链反应反应研究，微阵列和蛋白质组学分析。

如前所述，大多数程序都需要大量必须在物理上破坏的细胞，以便可以在纯文化中进一步隔离和增殖其成分以进行进一步分析。

一旦从源中分离出特定的细胞，就可以培养它们以允许进行详细的生化分析以及其他制剂研究。细胞培养的更多应用是：单克隆抗体，疫苗，酶，激素，白细胞室和某些生长因子。

细胞培养基本上是指在人工环境中生长的孤立细胞，该环境模仿其自然的条件〜与营养物质以及某些温度设置一样。

不同类型的细胞培养物：

1. 初级文化：这是通过机械或酶促度量直接从亲本植物或动物组织中制备细胞的。然后，通过合适的培养基在玻璃或塑料容器中保持细胞增殖，该玻璃或塑料容器模仿原始环境。可以完成此过程，而无需如前所述分开不同的单元格类型。
   
   原发性培养物中的细胞都具有相同的核型，类似于它们的原始组织。核型是指A（真核）细胞核中染色体的数量和外观。
   
   必须指出的是，由于底物和营养衰竭，原代培养的细胞的寿命有限，这会导致毒素堆积并抑制进一步的细胞生长。
   
   根据所使用的细胞类型，有两种不同类型的原代细胞培养：
   
   
   1. 粘附细胞：是指需要生长基质附着的细胞。这些通常是从细胞不动并包围结缔组织的器官组织中分离出来的。
      
      图1.粘附的单元格工作流程
      
   2. 悬浮细胞：与依从物相反，这些不需要锚固或附着即可成长。这些细胞取自血液系统。
      
      图2.悬架单元格工作流程
      
2. 二级文化：在此过程中，将原发性培养物的细胞转移到配有新培养基的新容器中，以促进连续的细胞增殖。该过程涉及在粘附的原发性培养物中解散粘附的细胞。这种次要培养的重要性是，通常，从原代细胞培养物中得出的细胞量不足以进行详细的研究，因此，随着二级培养的含量，细胞群随着其寿命而增加。
   
   此过程适用于生成复制的培养物，以进行表征，保存和进一步的实验。

对于使用原始和/或二级细胞培养物甚至细胞系工作的许多科学家来说，这已成为正常的程序。但是，它们都遇到了相同的问题，例如：

• 增长缓慢
• 自发分化
• 蒸发
• 污染等

参考：

1. Alberts，B.，Johnson，A.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K。，＆Walter P.（2002）。细胞的分子生物学：分离细胞并在培养中生长它们（第四版）。国家生物技术信息中心。取自：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk26851/
2. 疾病预防与控制中心。（2018）。了解疫苗的工作方式。取自：https：//www.cdc.gov/vaccines/hcp/conversations/downloads/vacsafe-understand-color-color-colore.pdf
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5. 科学方。（n.d。）。细胞系。取自：https：//www.sciendirect.com/topics/neuroscience/cell-lines
6. 科学方。（n.d。）。激光捕获微分解。取自：https：//www.sciendirect.com/topics/neuroscience/laser-capture-microssection
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细胞增殖是指细胞数量增加，这是正常细胞生长和分裂的直接结果。在疫苗/生物药物制剂的过程中，特定细胞被靶向并隔离，以提高患者的健康状况。一旦孤立了靶细胞，现在是时候在实验室中人为地种植它们以创建生物药物了。

调节细胞增殖

细胞增殖受到内部环境中营养水平，温度，pH和氧气等多种因素的调节。细胞还使用特殊的蛋白质和特定的信号系统来确保其正确的周期进展。

在静止阶段的细胞[GAP 0（G0）]可以进入细胞周期过程（G1）之前，必须首先被通常称为生长因子的特定蛋白质刺激。这些负责激活G0细胞的蛋白质分为四个主要组：生长因子，生长因子受体，信号传感器和核调节蛋白。通过直接刺激细胞核激活细胞生长。为此，生长因子必须与其位于细胞膜上的受体结合，然后将其暂时激活。之后，信号将从细胞表面受体传播到细胞核。因此，触发与细胞增殖有关的基因转录。

通常，细胞增殖由四个主要阶段组成：

1. 相间：gap 1（G1）阶段
   - 这是细胞大小增加并准备分裂的阶段。
2. 相间：合成相
   - 复制细胞DNA的相。
3. 相间：差距2（G2）阶段
   - 然后将组织和冷凝细胞DNA的副本；细胞准备分裂。
4. 有丝分裂（M）阶段
   - 细胞分裂过程，其中两个遗传物质的副本分为两个子细胞。

如前所述，细胞还使用信号系统来保证正确的细胞增殖。

• G1的结尾和G2检查点的开始：有助于评估合成前后DNA中可能损害的任何损害。
• 有丝分裂检查点：确保所有纺锤体纤维在染色体分离之前都正确布置（中期）（后期）。

通常，此类事件中检测到的任何异常都会迫使细胞凋亡或程序性细胞死亡。但是在存在缺陷蛋白的情况下，没有触发凋亡，而是可能发生恶性转化，这可能会导致癌症。

在生物药物领域，确保可再现和标准化细胞增殖方法的一种方法是通过使用生物反应器。此类设备系统是基于细胞的疗法必不可少的工具，因为它们保持了良好的控制微环境，可以轻松生长细胞。

生物反应器已被广泛用于膨胀红细胞，嵌合抗原受体（CAR）T细胞，诱导多能干细胞，甚至间质干细胞。

当今市场上有许多不同类型的生物反应器可用于依从文化。为细胞选择正确的生物反应器系统对于细胞培养成功至关重要。生物反应器系统使用的选择高度取决于要生产的细胞类型，所需的产物，细胞培养过程和产物密度。

作为ESCO HealthCare部门的一部分，ESCO VaccixCell为不同类型的粘附细胞提供了不同类型的生物反应器。

图3.生物反应器的潮汐技术

参考：

1. Anderson，H，（n.d。）。细胞增殖和细胞周期：定义与分化。显微镜主。取自：https：//www.microscopemaster.com/cell-proliferation.html
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细胞库是指特定细胞系，尤其是干细胞的收集，加工和存储，具有提供挽救生命的生物制药产品的能力。Cell Banking提供了一种可再现的方式，用于制造具有适当特征的高质量，安全和高效的生物产品。细胞库涉及的过程是安全，无创和无风险的。

特定的细胞系可以通过冷冻保存过程存储在细胞库中，该过程可以持续25年以上。冷冻保存利用非常低的温度来降低生物学和化学反应率，以保存细胞，细胞器，组织和/或任何其他生物学。但是，由于冰晶甚至渗透变化，该过程可能会致命伤害细胞，从而导致细胞机械约束。为了解决这一问题，使用了影响冰晶体生长，成核甚至水运输速率的冷冻保护剂（CPA）。

冷冻保存将生物样品置于悬浮动画状态，以在任何时间范围内保留细胞的精细结构，而这种冷冻保存的细胞甚至组织都具有研究甚至将来的临床研究的某些优势。

此外，这种冷冻保存的细胞和组织的持续可用性允许进行详尽的质量测试，以确定移植的适用性，而无需获得新鲜样品。

冷冻介绍方法

表1.不同的冷冻保存方法

• 缓慢的冷冻：该过程允许用CPA取代细胞塑性水，以减少细胞损伤并调整与细胞膜渗透性相关的冷却速率。从理论上讲，缓慢的冷却会导致细胞迅速泄漏细胞内液体，从而消除超冷和冰的形成。并且由于每个细胞具有不同的渗透率能力，因此最佳冷却速率取决于单元格类型
  
  缓慢冷冻的协议涉及估计的冷却速率为1°C/min，<10m CPA，具有高成本控制的速率冰柜或台式便携式冰点容器。
  
  好处：
  • 低风险
  • 不需要操纵技能
  劣势/s：
  • 由于细胞外冰的形成而导致细胞损伤的高风险。


• 玻璃化：这也称为“无冰”冷冻保存利用高浓度的CPA，以完全防止冰形成。在此过程中使用的CPA的浓度为4至8 M。但是，由于每个细胞的敏感性或毒性反应对如此高浓度的CPA的响应都有所不同，因此必须对每个细胞进行优化的不同方案。
  
  玻璃化取决于三（3）个因素：
  • 样品粘度
  • 冷却率
  • 样品量
  玻璃化方法：
  • 均衡：此过程需要制定冷冻保护剂（CPA）的多摩尔混合物及其注射到细胞悬浮液中。
  • 非平衡：使用这种方法的玻璃化利用基于载体的（石英微毛细血管和冰棍素等）或无载体系统的冻结速率条件，CPA混合物浓度较低。

必须针对每种细胞类型进行适当优化细胞库协议，以开发和维持细胞活力，恢复，效力和整体，以确保最终的生物制药产品安全性。

参考：

1. Akel，S。（2015）。细胞银行：过程开发和细胞保存。科学方。取自：https：//www.sciendirect.com/science/article/pii/b9780124103962000037
2. 查尔斯河。（n.d。）。细胞银行。取自：https：//www.criver.com/products-services/biologics-testing-solutions/manufacturing-production/cell-banking？region = 3701
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5. Jang，T.，Park，S.，Yang，J.，Kim，J.，Seok，J.，Park，U.，Choi，C.，Lee，S。，＆Han，J。（2017年）。冷冻保存及其临床应用。综合医学研究，6（1），12-18。doi：10.1016/j.imr.2016.12.001

作为生物制药行业的一部分，重要的是要确保所有原材料和关键成分的及时可用性和可重复性。发酵过程在上述行业至关重要，因为它促进了生物制药，食品/饲料补充剂，生物燃料甚至化学构件的形成。

由于这是一个关键的过程，因此生物处理科学家和工程师必须优化可再现且具有成本效益的方法来维持它。为此，必须考虑以下因素：

• 媒体和补品的费用
• 流程运行时
• 细菌生长和生存能力
• 产品滴度和产量
• 产品质量
• 培养基培养物和副产品的培养基

过程开发也是生物处理工程师将确定其将要使用的特定细胞或样品的最佳发酵方法的同时。

发酵方法

• 批处理发酵：这种方法使用发酵罐内部的固定体积，其中微生物将被接种。需要定期更改培养基，以防止细胞及其副产品饱和。
  
  微生物将受到不同的生长阶段：初始滞后，指数增长，固定生长和死亡阶段。
  
  初始滞后阶段是指细胞习惯发酵罐和培养基提出的新环境的时期；因此，这里的增长很慢。虽然，一旦细胞完全适应介质的条件，他们现在将进入指数阶段或对数阶段其中发生了细胞分裂。可以预见的是，这一阶段标记为细胞群的增加一倍。只要细胞的环境条件是最佳的，就会看到快速的细胞生长，并在生长曲线上标有陡峭的斜率。
  
  但是，一旦增加的细胞种群消耗了培养基中存在的基本营养素，他们现在将进入固定生长阶段。到这个时候，产生的新细胞数量等于死亡的细胞数量，导致生长曲线的变平。值得注意的是，在此阶段产生的新细胞试图适应饥饿条件，因此，它们的尺寸较小，质膜较小，液体较小，渗透性较低，并且它们的核酸凝结与DNA与DNA结合的蛋白质与饥饿细胞结合在一起（DPS）。此外，在固定相中产生的细胞容易产生次生代谢物可以是抗生素。在此时间点，任何其他能够散发过程的细胞都将被激活。
  
  最后一个阶段是死亡或衰落阶段其中，可行细胞的数量以指数级的方式减少。到这个时候，培养条件可能已经恶化到以无法弥补的方式伤害或损害细胞的点。值得注意的是，研究表明，即使在恶劣条件下，细胞突变和适应，100％的细胞死亡也极不可能。因此，观察到尾随效应，其中一个小细胞群不能被杀死，并从同一培养物中死细胞的裂解中获取营养。
  
  研究表明了一种称为可行但不可培养（VBNC）这表明可以恢复死细胞。这项研究对于能够在恶劣的条件下输入低代谢和没有细胞分裂的病原体可能具有重要意义，但在恶劣的条件下，恢复了具有更好培养条件的此类活动。
  
  批处理处理的优点：
  
  • 易于操作
  • 低污染风险
  批处理处理的缺点：
  
  • 低细胞密度
  • 清洁，船只设置和灭菌引起的批次之间的停机时间很长
  为了初步研究和建立实验设计，批处理发酵提供了一种优化培养条件的方便方法。


• 美联储发酵：这是生物处理行业中广泛使用的过程，是批处理发酵方法的修改版本。在饲料批次发酵中，微生物是接种和生长的，而营养成分则以增量添加到发酵罐中。该过程持续在发酵的整个持续时间内供应微生物。设计用于进食的时间范围不应允许过度饱和，以适当支持接种生长；特别是因为喂养时期通常以肉汤中的底物限制为标志。在每次运行结束时，培养悬架被去除。
  
  饲料批次发酵过程对于需要高产品产量的生物处理很有用。
  
  美联储发酵的优势：
  
  • 对于需要底物抑制的生物处理至关重要。
  • FED批次可以帮助控制底物的喂食速率，从而达到所需产品的最大收益率。
  • 积累非增长相关产品的有效方法（例如抗生素）
  • 克服分解代谢物抑制现象
  • 可以使用有机溶剂作为营养源
  • 通过操纵极限底物的饲料来控制反应速率和代谢反应。
  
  
• 连续发酵：此过程提供新的培养基，并收集培养的细胞，同时消除所有使用的培养基。持续去除有毒废物和用消耗的培养基可以使培养体积保持恒定。与饲料批量发酵不同，血管的最大体积不会影响可以在整个过程中添加到整个培养物中的新鲜培养基的量。
  
  连续发酵通常在工业范围内使用。
  
  连续发酵的优势：
  
  • 简化文化规模
  • 可以在细胞生长速率和环境条件保持恒定的情况下实现稳态。
  • 培养样品的寿命更长
  • 减少流程停机时间
  • 成本效益
  
  连续发酵的缺点：
  
  • 由于较长的耕种期，挑战不育维持

参考：

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